Это было достигнуто путем перепрограммирования «экзосом», которые представляют собой небольшие пузырьки (диаметр ~ 120 нм), которые клетки используют для передачи межклеточных сигналов. Исследователи провели эксперименты с использованием микрожидкостных капельных реакторов, которые генерировали маленькие капли, которые были такого же размера, как и типичные клетки. (диаметр ~ 10 нм) Исследователи сначала стремились облегчить контролируемое слияние этих экзосом внутри капель, одновременно предотвращая нежелательное слияние.
Они достигли этого, приспособив поверхности экзосом к молекулам, называемым катехолом, который является хелатирующим агентом, который образует комплексы с ионами металлов.
Это, в свою очередь, было сделано путем присоединения катехола к антителам, которые нацелены на специфические клеточные маркеры, такие как CD9. Комплексообразующее свойство катехола позволяет им управлять слиянием экзосом, когда они смешиваются с ионами металлов, такими как Fe3+. Слияние мембран происходит, когда катехолы на поверхности связываются с железом и приближают пузырьки друг к другу.
Исследователи сначала проверили эффективность этой системы, загрузив один тип экзосом кальцеином-Co2 +, а другой – ЭДТА.
Когда две везикулы сливаются и содержимое смешивается, ЭДТА улавливает Co2 + от кальцеина, что затем позволяет последнему флуоресцировать. Команда поняла, что они были успешными после обнаружения сигнала флуоресценции, и слияние было дополнительно подтверждено удвоением измеренного диаметра экзосомы.
Затем эти индивидуализированные экзосомы были предварительно загружены различными реагентами и ферментами, которые превратили их в биомиметические нанофабрики.
Это позволяет им производить ценные биомолекулы, выполняя желаемые биокаталитические превращения в пространственно ограниченном пространстве, что невозможно при использовании обычных лабораторных пробирок. Команда продемонстрировала этот мультиферментный биокаталитический каскад, инкапсулируя глюкозооксидазу (GOx) и пероксидазу хрена (HRP) внутри экзосом. GOx сначала преобразует глюкозу в глюконовую кислоту и перекись водорода. HRP, в свою очередь, использует перекись водорода, образующуюся в первой реакции, для окисления Amplex Red до флуоресцентного продукта, резоруфина.
Исследователи даже смогли сделать шаг вперед, добавив в смесь третий фермент, галактозидазу, которая превращает лактозу в глюкозу.
Затем исследователи хотели узнать, насколько хорошо эти мини-реакторы могут быть поглощены и усвоены клетками. Клетки, полученные из тканей груди человека, питались нанореакторами слитых экзосом, и их интернализация в течение следующих 48 часов наблюдалась с использованием различных маркеров и конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM).
Было обнаружено, что клетки способны поглощать эти индивидуализированные экзосомы в основном за счет эндоцитоза, а также множества других механизмов. Они дополнительно протестировали вышеупомянутую двух ферментную систему GOx-HRP в клетках, и было обнаружено, что слитые экзосомы способны успешно производить флуоресцентные продукты, даже находясь внутри клеток.
Вооружившись этими знаниями, команда стремилась создать функциональные искусственные митохондрии, способные производить энергию внутри клеток. Для этого АТФ-синтаза и bo3-оксидаза были преобразованы в более ранние экзосомы, содержащие GOx и HRP, соответственно.
Эти экзосомы, в свою очередь, были слиты, чтобы создать нанореакторы, которые могут производить АТФ с использованием глюкозы и дитиотреитола (DTT). Было обнаружено, что слитые экзосомы способны проникать глубоко в центральную часть твердой сфероидной ткани и продуцировать АТФ в ее гипоксической среде. Активность этих простых органелл сопровождалась заметным снижением генерации активных форм кислорода (АФК). Напротив, свободные ферменты не могли проникнуть внутрь этих плотно упакованных сфероидов клеток.
«Взятые вместе, наши результаты подчеркивают потенциал этих экзосом в качестве нанореакторов в регулировании метаболической активности клеток внутри сфероидов и в ослаблении повреждения клеток из-за гипоксии», – отмечает ЧО Юн-Кён, автор исследования. Есть надежда, что дальнейшие исследования таких искусственных органелл представят новую парадигму в различных областях, таких как диагностика и лечение заболеваний, биотехнология, медицина и окружающая среда.