Биоразлагаемый полиэфирный полигидроксиалканоат (PHA) рекламируется как экологически чистый биопластик, который заменит существующие синтетические пластмассы. Имея свойства, аналогичные свойствам пластмасс общего назначения, таких как полиэтилен и полипропилен, PHA может использоваться в различных промышленных приложениях, таких как упаковка контейнеров и одноразовые изделия.
PHA синтезируется многочисленными бактериями в качестве материала для хранения энергии и углерода в условиях несбалансированного роста в присутствии избыточных источников углерода. ФГА существует в форме нерастворимых гранул в цитоплазме. Предыдущие исследования гранул ФГА in vivo проводились с использованием флуоресцентной микроскопии, просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и электронной криотомографии.
Эти методы обычно основаны на статистическом анализе нескольких 2D снимков фиксированных ячеек или краткосрочном мониторинге ячеек. Для ПЭМ-анализа клетки необходимо зафиксировать и разделить на срезы, поэтому исследование живых клеток было невозможно. Методы, основанные на флуоресценции, требуют флуоресцентного мечения или окрашивания красителем. Таким образом, непрямая визуализация с использованием репортерных белков не может показать нативное состояние PHA или клеток, а инвазивные экзогенные красители могут влиять на физиологию и жизнеспособность клеток.
Следовательно, было трудно полностью понять формирование гранул ПГА в клетках из-за технических ограничений, и поэтому было предложено только несколько моделей механизмов, основанных на наблюдениях.
Команда исследователей метаболической инженерии во главе с выдающимся профессором Сан Юп Ли и профессором физики Юн Кыном Паком, которые основали стартап Tomocube с помощью своей трехмерной голографической микроскопии, сообщила о результатах трехмерного количественного анализа гранул PHA без меток в отдельных живых бактериальных клетках путем измерения распределения показателя преломления с помощью оптической дифракционной томографии.
Образование и рост гранул PHA в клетках Cupriavidus necator, наиболее изученного нативного продуцента PHA (в частности, поли (3-гидроксибутирата), также известного как PHB), и рекомбинантной Escherichia coli, несущей C. necator пути биосинтеза ПОБ были сравнительно исследованы.
На основе реконструированного трехмерного распределения показателя преломления клеток команде удалось выполнить трехмерную визуализацию и количественный анализ клеток и внутриклеточных гранул PHA на уровне отдельных клеток. В частности, команда недавно представила концепцию «плотности гранул ФГА in vivo."Путем статистического анализа сотен отдельных клеток, накапливающих гранулы PHA, были обнаружены отличительные различия в плотности и локализации гранул PHA в двух микроорганизмах. Кроме того, команда определила ключевой белок, который играет важную роль в изменении характеристик гранул PHA в рекомбинантном E. coli, чтобы стать похожим на C. некатор.
Исследовательская группа также представила трехмерные видеоролики, показывающие фактические процессы образования гранул PHA в сочетании с ростом и делением клеток. О фильмах, показывающих, как живые клетки синтезируют и накапливают гранулы PHA в их естественном состоянии, никогда раньше не сообщалось.
Профессор Ли сказал: «Это исследование дает представление о морфологических и физических характеристиках in vivo PHA, а также об уникальных механизмах образования гранул PHA, которые претерпевают фазовый переход от растворимых мономеров в нерастворимый полимер с последующим образованием гранул. Благодаря этому исследованию теперь возможно более глубокое понимание образования гранул PHA в бактериальных клетках, что имеет большое значение в том, что было достигнуто изучение конвергенции биологии и физики. Это исследование поможет разработать различные процессы производства биопластиков в будущем."