Подобно японскому искусству складывания бумаги, ДНК-оригами – это складывание длинных гибких цепочек ДНК в желаемые формы на наномасштабе (миллиардные доли метра) путем «скрепления» различных частей цепи дополнительными парами оснований коротких цепей ДНК. Эти программируемые и точно контролируемые наноразмерные архитектуры могут быть полезны для многих биомедицинских приложений, включая адресную доставку лекарств и генов в нужные ткани или клетки, визуализацию биологических процессов внутри тела и биосенсор для обнаружения заболеваний или мониторинга здоровья. Однако для реализации таких приложений потребуются решения для защиты структур ДНК-оригами в сложных биологических жидкостях и реализации новых функций, не присущих ДНК.
«Одним из ограничивающих факторов в применении преимуществ ДНК-оригами в отношении структуры и формы в наномедицине является то, что наноструктура ДНК, помещенная внутрь человеческого тела, может легко перевариваться ферментами или разрушаться в ответ на изменения в составе раствора или уровне pH», объяснил первый автор Ши-Тинг (Кристин) Ван, постдок группы мягких и биологических наноматериалов Центра функциональных наноматериалов (CFN) в U.S. Брукхейвенская национальная лаборатория Министерства энергетики (DOE). «В этом исследовании мы синтезировали биосовместимые молекулы, называемые пептоидами, с четко определенным составом молекулярной последовательности и длиной. Мы покрыли этими пептоидами ДНК-оригами октаэдрической формы, обладающую высокой механической стабильностью и большим открытым пространством для перевозки наноразмерных грузов, таких как низкомолекулярные противораковые препараты. Наши демонстрации показали, что пептоидные покрытия эффективно защищают ДНК оригами в различных физиологических условиях и поддерживают добавление различных химических функций для биомедицинских приложений."
Пептоиды напоминают пептиды или короткие цепочки аминокислот. Однако в пептоидах боковые цепи (химические группы, прикрепленные к основной цепи или остову молекулы) прикреплены к азоту, а не к углероду. Кроме того, пептоиды более гибкие из-за отсутствия водородных связей в основной цепи.
Эту гибкость можно использовать для контроля того, как пептоиды связываются с ДНК оригами.
«Наша цель состояла в том, чтобы сделать минималистичное покрытие, которое не увеличивало бы объем оригами, но в то же время было бы достаточно эффективным, чтобы обеспечивать защиту, растворимость и совместимость с различными биофункциями», – сказал автор-корреспондент Олег Ганг, лидер CFN Soft and Bio Nanomaterials Group и профессор химической инженерии, прикладной физики и материаловедения в Columbia Engineering. "Если оригами с покрытием станет громоздким, это повлияет на его форму, а также на то, как оно взаимодействует с другими биомолекулами и оригами и вмещает их, что вызовет ряд осложнений."
Ван и Ганг при помощи сотрудника из Имперского колледжа Лондона использовали оборудование Молекулярной литейной (MF) Национальной лаборатории Лоуренса Беркли для синтеза двух видов пептоидных архитектур для защиты ДНК-оригами: кистевого и блочного. Обе архитектуры имеют ДНК-связывающий домен (положительно заряженную часть, которая связывается с отрицательно заряженной ДНК) и водорастворимый домен (часть, которая обеспечивает окружение ДНК молекулами воды, которые необходимы для стабилизации).
Архитектура типа кисти чередуется между этими двумя доменами, тогда как архитектура блочного типа объединяет их в кластеры, чтобы сформировать отдельные "блоки"."
Чтобы определить, какой тип лучше обеспечивает защиту, ученые изучили связывание двухцепочечной (дуплексной) ДНК и пептоидов. Эксперименты с флуоресцентным красителем (который связывается с ДНК) показали, что специфическая архитектура щеточного типа наиболее эффективна для стабилизации дуплексной ДНК, покрытой пептоидами, при высокой температуре.
Сотрудник из Университета RMIT в Австралии смоделировал взаимодействия ДНК с пептоидом на молекулярном уровне, чтобы понять, почему.
«Мы считаем, что чередующаяся структура обеспечивает баланс, поскольку некоторые части находятся внутри канавки двойной спирали ДНК для обеспечения защиты, в то время как другие части выступают, чтобы благоприятно взаимодействовать с водой», – сказал Ван. «Оптимальная конфигурация – щеточный тип с 12 ДНК-связывающими и 12 водорастворимыми группами."
Руководствуясь этими исследованиями, команда исследовала структурную стабильность покрытых пептоидом ДНК-оригами в нескольких типах физиологически значимых условий: в растворе, содержащем низкую концентрацию положительно заряженных ионов магния (Mg), в растворе, содержащем специфичные для ДНК нуклеазой (тип фермента) и инкубируют в среде для культивирования клеток (содержащей как нуклеазы, так и ионы Mg в низкой концентрации).
Обычно высокая концентрация ионов магния требуется для стабилизации ДНК-оригами за счет уменьшения отталкивания отрицательных зарядов ДНК-ДНК, но физиологические жидкости содержат гораздо более низкие концентрации.
Для своих исследований они использовали комбинацию экспериментальных методов: электрофорез в агарозном геле, метод разделения фрагментов ДНК (или других макромолекул) на основе их заряда и размера; просвечивающая электронная микроскопия и динамическое рассеяние света на CFN; и малоугловое рассеяние рентгеновских лучей в реальном времени на линии пучка рентгеновского рассеяния (LiX) Брукхейвенского национального синхротронного источника света II (NSLS-II). Результаты показали, что структура оригами осталась нетронутой после того, как она была покрыта специально разработанными пептоидами и помещена в различные физиологические условия.
После этих экспериментов ученые провели серию демонстраций в сотрудничестве с группой Бертоцци из Стэнфордского университета, чтобы изучить, как оригами с пептоидным покрытием можно использовать в биомедицинских приложениях.
Например, они загрузили химиотерапевтический препарат доксорубицин в покрытые оригами. Доксорубицин является одним из препаратов, которые обычно назначают пациентам с HER2-положительным раком молочной железы, при котором сверхэкспрессия белка HER2 (рецептора на клетках груди) вызывает неконтролируемое деление и рост клеток.
За 48 часов оригами с покрытием высвободило меньше доксорубицина, чем его аналог без покрытия, что измерялось по интенсивности собственной флуоресценции лекарства.
«Конечная цель – иметь возможность регулировать скорость высвобождения во время процесса доставки лекарства для контроля биологических и токсических эффектов», – пояснил Ван.
Во второй демонстрации нанокарго они исследовали, могут ли белки доставляться аналогичным образом.
Они инкапсулировали белок коровьего происхождения (прикрепленный к флуоресцентным молекулам для визуализации) внутри покрытого оригами в присутствии фермента трипсина, переваривающего белок. Переваривание этого инкапсулированного белка трипсином было снижено и замедлено из-за комбинации самого ДНК-оригами и пептоидного покрытия.
В заключительной демонстрации они функционализировали поверхность покрытой пептоидом ДНК-оригами с помощью трастузумаба. Трастузумаб, более известный под торговой маркой Герцептин, представляет собой антитело, нацеленное на рецепторы HER2.
Связываясь с этими рецепторами, трастузумаб блокирует получение раковых клеток химических сигналов, необходимых для роста. Они достигли функционализации поверхности, добавив химические группы в определенные участки молекулы трастузумаба и в пептоидные последовательности. Посредством «химии щелчков» эти группы избирательно реагируют с образованием ковалентных связей (подобно щелчку пряжки ремня безопасности).
В последующих экспериментах Ван планирует изучить потенциал комбинаторной терапии, в которой ДНК-оригами, покрытая пептоидом, несущая доксорубицин и имеющая функционализированную трастузумабом поверхность, нацелена на HER2-положительные клетки рака молочной железы.
Ван получила финансирование в рамках Программы развития технологий Брукхейвена для дальнейшего развития этой технологии на основе предложения, которое она разработала в качестве участника второго учебного семинара по предпринимательству, организованного Брукхейвенским офисом трансфера технологий в апреле 2019 года. Юридическая группа по интеллектуальной собственности Брукхейвена недавно подала предварительную заявку на патент на методологию пептоидного дизайна в U.S. Бюро по патентам и товарным знакам.
«Сейчас мы переходим к стадии трансляции, проводя эксперименты с использованием клеток и, возможно, целых организмов», – сказал Ганг.