Крошечные защитники генома состоят из коротких цепочек РНК – молекулярного родственника ДНК – называемой пиРНК.
«Нас интересует, как создаются piRNA, потому что эти молекулы являются частью фундаментального пути, который животные от насекомых к человеку используют для защиты своих геномов зародышевых клеток. Мы знаем, что пиРНК важна для фертильности, а также вовлечена в некоторые виды рака », – сказал профессор Юкихиде Томари, руководитель исследовательской группы Института количественных биологических наук Токийского университета.
Хотя исследователи признают их фундаментальную важность, многочисленные проблемы сделали изучение пиРНК медленным и трудным.
Команда UTokyo обнаружила, что белок под названием Zucchini перерабатывает piRNA из длинной незрелой формы в более короткую промежуточную форму. Затем эта промежуточная пиРНК превращается в функциональную форму с помощью другого белка, называемого триммером. Кроме того, последовательность РНК, которую кабачок распознает как сигнал для разрезания длинной незрелой пиРНК, является более сложной, чем считалось ранее.
Путь к пиРНК
Исследователи начали с генетической модификации клеток яичников тутового шелкопряда, чтобы они не могли завершить последний этап созревания пиРНК с помощью триммера, оставив клетки с большим количеством промежуточных пре-пиРНК для изучения.
«Получение полностью модифицированных клеток было большой технической проблемой, поскольку мы не знали, каков был истинный эффект изменения пути piRNA и что могло быть случайным побочным эффектом генетической модификации», – сказал научный сотрудник Нацуко Изуми, биохимик и соавтор. автор недавней публикации.
Предыдущие отчеты других групп размывали роль белка цуккини, спор, который Томари объясняет внутренней трудностью изучения пути продукции piRNA вне полного клеточного контекста. Фактически, и кабачки, и триммер находятся на поверхности «энергетических фабрик» клеток, митохондрий, но белки теряют свои первоначальные характеристики после очистки.
Инновационный метод команды UTokyo по изучению «сырых клеточных гранул», где белки могут функционировать в более естественной ситуации на митохондриальной поверхности, показал, что кабачки действительно разрезают длинные незрелые пиРНК и превращают их в промежуточные пре-пиРНК.
Более того, исследователи обнаружили, как кабачок распознает, где разрезать нити РНК.
«Секвенирование следующего поколения может производить огромное количество данных, но в виде смеси значимых сигналов и случайного шума. Самой сложной задачей было очистить набор данных и организовать из них гипотезу, которую можно экспериментально проверить », – пояснил научный сотрудник Кейсуке Сёдзи, специалист по биоинформатике и соавтор исследовательской работы.
После анализа Сёдзи идентифицировал новый мотив в последовательностях РНК, где цукини предпочитает разрезать незрелую цепь РНК. Дополнительные эксперименты с использованием сырых гранул клеток, проведенные Izumi, подтвердили, что изменение мотива предотвращает нормальную продукцию пре-пиРНК кабачками.
«Мы были удивлены, узнав, что простая подпись последовательности, которая считалась отличительной чертой распознавания цукини, на самом деле не является существенной, но цукини предпочитает гораздо более сложный мотив. Мы предполагаем, что путь piRNA настолько сложен, потому что piRNA важна для защиты генома от различных последовательностей захватчиков и защиты фертильности – клеткам нужна гибкая и надежная система защиты », – сказал Томари.
Инновации в изучении пиРНК
Исторически сложилось так, что исследователи изо всех сил пытались собрать достаточно материала для изучения пути piRNA, потому что он обычно активен только в половых клетках.
«Мы делали это в прошлом, но отделение яичников от насекомых – сложная задача», – пояснил Томари.
Первое нововведение появилось в 2009 году, когда тогдашний аспирант Синпей Каваока и доцент Сусуму Кацума из отдела сельскохозяйственной и экологической биологии UTokyo обнаружили непрерывное производство пиРНК в клетках, взятых из яичника тутового шелкопряда и выращенных в лабораторной посуде.
Однако новые открытия в отношении piRNA по-прежнему основывались только на генетическом анализе, а не на прямом наблюдении за молекулами, участвующими в производстве piRNA. Обычная техника вскрытия клеток и анализа «чистой» легкой жидкой части выявила только то, что путь piRNA там не активен.
В 2011 году исследовательская группа Томари вместе с Каваока, который сейчас возглавляет собственную исследовательскую группу в Киотском университете, и Кацума сделали свое второе нововведение.
"Это было счастливой случайностью", – вспоминает Томари.
Поскольку ничто другое не помогало, Каваока попытался проанализировать ту часть клеток, которая обычно выбрасывается в биохимии – то, что Томари называет «сырой грязной осадкой», состоящей из всех твердых частиц, оставшихся после того, как клетки вскрылись.
«Современным биологам это может показаться безумной идеей, но такой подход является ключом к нашим исследованиям», – сказал Томари.
Затем, в 2016 году, Идзуми тщательно разделил различные компоненты в неочищенном осадке клеток и обнаружил, что активность процессинга piRNA находится на поверхности митохондрий, что привело к раскрытию давно искомой идентичности фермента Trimmer.
С момента разработки этих инноваций исследовательская группа работала над детальным определением пути производства пиРНК и планирует продолжить характеризацию ранних и более поздних стадий пути пиРНК.