Теперь исследователи из Центра биодизайна для прикладных структурных открытий и Школы молекулярных наук АГУ вместе со своими коллегами исследуют критически важный класс белков, которые украшают внешние мембраны клеток. Такие мембранные белки часто действуют как рецепторы для связывающих молекул, инициируя сигналы, которые могут изменять поведение клетки различными способами.
Новый подход к сбору структурных данных мембранных белков с поразительными подробностями описан в новом исследовании.
Используется новейший набор инструментов криогенной электронной микроскопии (или крио-ЭМ). Кроме того, использование так называемой кристаллизации LCP и дифракции электронов на микрокристаллах (MicroED) помогает выявить структурные детали белков, которые были в значительной степени недоступны с помощью традиционных подходов, таких как рентгеновская кристаллография.
Полученные данные описывают первое использование микрокристаллов, встроенных в LCP, для выявления структурных деталей белка с высоким разрешением с помощью MicroED. Новое исследование украшает обложку текущего номера журнала Cell Press. Структура.
«LCP был большим успехом в кристаллизации мембранного белка, – говорит Вэй Лю, автор-корреспондент нового исследования. «Новое широкое применение LCP-MicroED предлагает улучшенные подходы к структурному определению сложных белковых мишеней. Эти структурные схемы могут быть использованы для облегчения разработки новых терапевтических лекарств на основе более точных представлений."
Одним из классов мембранных белков, представляющих особый интерес, являются рецепторы, связанные с G-белками (GPCR), которые образуют самую большую и наиболее разнообразную группу мембранных рецепторов, обнаруженных у эукариотических организмов, включая человека.
Физиологическая активность GPCR настолько важна, что они являются основной мишенью для широкого спектра терапевтических препаратов. Однако именно здесь возникают проблемы, поскольку определение детальной структуры мембранных белков – важного предшественника точного дизайна лекарств – часто представляет собой огромные проблемы.
Техника рентгеновской кристаллографии использовалась для исследования структур на атомном уровне и даже динамического поведения многих белков. Здесь кристаллизованные образцы исследуемого белка облучаются рентгеновским лучом, в результате чего на экране появляются дифракционные картины.
Сборка тысяч снимков дифракции позволяет собрать трехмерное структурное изображение с высоким разрешением с помощью компьютеров.
Тем не менее, многие мембранные белки, включая GPCR, не образуют больших, хорошо упорядоченных кристаллов, подходящих для рентгеновской кристаллографии. Кроме того, такие белки хрупкие и легко повреждаются рентгеновским излучением. Решение проблемы потребовало использования специальных устройств, известных как рентгеновские лазеры на свободных электронах или XFELS, которые могут доставлять яркую вспышку рентгеновского света длительностью всего фемтосекунды (фемтосекунда равна одной квадриллионной секунды или примерно время, необходимое лучу света, чтобы пересечь диаметр вируса).
Методика серийной фемтосекундной рентгеновской кристаллографии позволяет исследователям получить изображение преломления до того, как кристаллизованный образец будет разрушен.
Тем не менее, кристаллизация многих мембранных белков остается чрезвычайно трудным и неточным делом, и в мире существует лишь несколько таких гигантских аппаратов XFEL.
Откройте для себя криогенную электронную микроскопию и MicroED. Этот новаторский метод включает мгновенное замораживание кристаллов белка в тонком слое льда, а затем воздействие на них пучка электронов.
Как и в случае рентгеновской кристаллографии, метод использует дифракционные картины, на этот раз от электронов, а не от рентгеновских лучей, для сборки окончательных детальных структур.
MicroED отлично справляется со сбором данных с кристаллов, слишком маленьких и неправильных для использования в традиционной рентгеновской кристаллографии.
В новом исследовании исследователи использовали два передовых метода в тандеме для получения дифракционных изображений с высоким разрешением двух важных модельных белков: протеиназы K и аденозинового рецептора A2A, функции которых включают модуляцию нейротрансмиттеров в головном мозге, сердечную вазодилатацию и T- клеточный иммунный ответ.
Белки были встроены в особый тип кристалла, известный как липидная кубическая фаза или кристалл LCP, который имитирует естественную среду, в которой такие белки встречаются в природе. Затем образцы LCP были подвергнуты электронной микроскопии с использованием метода MicroED, который позволяет получать изображения чрезвычайно тонких кристаллов субмикронного размера. Кроме того, непрерывное вращение кристаллов LCP под электронным микроскопом позволяет получать несколько дифракционных картин с одного кристалла с чрезвычайно низкой дозой электронов без повреждений.
Возможность исследовать белки, которые могут образовывать только микро- или нанокристаллы, открывает дверь к структурному определению многих жизненно важных мембранных белков, которые ускользнули от традиционных методов исследования, особенно GPCR.