Более безопасное редактирование генов CRISPR с меньшим количеством попаданий не в цель

В системе CRISPR используется фермент Cas9 для расщепления ДНК. Cas9 разрежет практически любую последовательность ДНК. Его специфичность проистекает из его взаимодействия с «направляющей РНК» (гРНК), последовательность которой позволяет ей связываться с целевой ДНК посредством сопоставления пар оснований. Как только это произойдет, фермент активируется и ДНК разрезается.

Система CRISPR обнаружена у нескольких видов бактерий; среди тех, которые обычно используются в исследованиях, преимущество Staphylococcus aureus заключается в размере – в отличие от некоторых других, его ген достаточно мал, чтобы поместиться в универсальный и безвредный вектор генной терапии, называемый аденоассоциированным вирусом, что делает его привлекательным для терапевтических целей.
Ключевое ограничение любой из систем CRISPR, в том числе от S. aureus, расщепление ДНК вне мишени.

Направляющая РНК может слабо связываться с сайтом, последовательность которого близка, но несовершена; в зависимости от того, насколько близко совпадение и насколько тесно фермент взаимодействует с парным комплексом гРНК-ДНК, фермент может активироваться и неправильно разрезать ДНК с потенциально опасными последствиями.
Чтобы выяснить, является ли S. aureus Cas9 можно было модифицировать для расщепления с более высокой точностью до намеченной мишени, авторы создали ряд новых мутантов Cas9 и протестировали их способность различать несовершенные совпадения, сохраняя при этом высокую активность в намеченном сайте.

Они обнаружили один такой мутант, который различал и отклонял несоответствия одной пары оснований между гРНК и ДНК, независимо от мишени, увеличивая точность до 93 раз по сравнению с исходным ферментом. Они показали, что мутация затронула часть домена узнавания, область фермента, которая координирует контакты между ферментом и комплексом гРНК-ДНК.

Мутация имела вероятный эффект ослабления этих контактов, таким образом гарантируя, что только самая сильная пара, которая будет происходить из идеального совпадения последовательностей, будет запускать активность фермента.
«Избежание расщепления вне мишени является важной задачей для разработки CRISPR для медицинских вмешательств, таких как коррекция генетических заболеваний или нацеливание на раковые клетки», – сказал Гу. "Наши результаты указывают путь к разработке потенциально более безопасных стратегий генной терапии."

Пластиковые машины