Этот инструмент молекулярной биологии, разработанный и утвержденный исследователями из Университета Алабамы в Бирмингеме, способен выборочно и надежно включать гены в нейронах. Он был доставлен в нейроны, растущие в чашке, и, что более важно, он также был доставлен в нейроны мозга живых взрослых крыс. Инструмент может увеличить экспрессию одного гена или экспрессию нескольких генов одновременно, а степень увеличения экспрессии гена можно контролировать.
Эта избирательная способность увеличивать экспрессию гена – что означает, что ген вырабатывает больше мРНК, кодирующей большее количество белка – позволяет исследователям задавать вопросы о роли отдельных генов или групп генов.
Такие запросы являются строительными блоками, чтобы узнать, как экспрессия различных генных программ во время развития контролирует рост мозга, проводку и типы создаваемых нейронов. Для мозга взрослого этот инструмент может помочь объяснить, как генные программы, измененные нейронной активностью и поведенческим опытом, приводят к адаптивному поведению. Этот инструмент также может помочь исследовать нарушение регуляции генных программ, многие из которых связаны с нейропсихиатрическими заболеваниями, которые возникают во время развития мозга или в полностью развитом мозге взрослого человека.
Инструмент использует известную технологию на основе CRISPR, которая была упакована в лентивирусы для стабильного внедрения в нейроны.
«Технология на основе CRISPR предоставила новые возможности для исследования функции генов, но трудности с экспрессией трансгена в постмитотических нейронах задерживают включение этих инструментов в центральную нервную систему», – сказал Джереми Дэй, доктор философии.D., руководитель исследовательской группы UAB. «Здесь мы демонстрируем высокоэффективную, оптимизированную для нейронов двойную лентивирусную систему транскрипционной активации на основе CRISPR, способную к надежной, модульной и настраиваемой индукции генов и мультиплексной регуляции генов в нескольких первичных системах культивирования нейронов грызунов."
Дэй – доцент кафедры нейробиологии Медицинской школы UAB и научный сотрудник Международного исследовательского центра UAB Civitan. Исследование опубликовано в журнале eNeuro вместе с Кэтрин Э. Савель и Светлана В. Бах, Ph.D., UAB Department of Neurobiology, как соавторы.
«С развитием технологии CRISPR мы получили возможность выборочно редактировать гены и уровни экспрессии генов по запросу», – сказала Эрин Калипари, доктор философии.D., доцент Института мозга Вандербильта при Университете Вандербильта, который не принимал участия в исследовании. «Это предоставило новый мощный инструмент для увязки эффектов экспрессии генов и регуляции генов с клеточными функциями и поведением; но до сих пор эти системы были в первую очередь оптимизированы для использования в культуре клеток."
«Хотя это звучит банально, – сказал Калипари, – перенести генетический инструмент из культуры для использования in vivo невероятно сложно. Эта технология собирается произвести революцию в использовании этих систем in vivo, чтобы связать изменения регуляторов транскрипции в определенных генах в определенных областях мозга с нейронной активностью и поведением. Кроме того, эти инструменты позволят осуществлять регионально-зависимые манипуляции с отдельными генами или группами генов у бодрствующих и ведущих себя животных, что даст нам беспрецедентное представление о роли экспрессии генов в поведении."
«Понимание основных механизмов, управляющих этим процессом, – сказала она, – это первый шаг к разработке селективных методов лечения психических заболеваний."
Детали исследования
Система CRISPR / Cas9 широко известна как молекулярные ножницы, которые могут разрезать определенный участок генома, чтобы удалить ген или добавить ген. Неактивная форма CRISPR / Cas9, которая не может разрезать ДНК, может быть соединена с эффекторами транскрипции для активации экспрессии гена в определенном месте.
Дэй и его коллеги использовали эту систему под названием CRISPRa. Они упаковали его в лентивирусы, чтобы обеспечить стабильную экспрессию механизма CRISPR, что позволило исследователям проверить его способность регулировать гены в нейронах. Система включает CRISPR-дефект-Cas9 с активаторами и единственную направляющую РНК, которая направляет CRISPR-dCas9 в точную точку генома.
Одним из ограничений использования CRISPRa в нейронах является то, что промоторы, которые обычно используются для управления молекулярными механизмами в других типах клеток, неэффективны при управлении экспрессией CRISPR в нейронах.
Чтобы обойти это, исследователи UAB выбрали нейрон-специфический промотор на основе промоторной последовательности гена Synapsin или SYN человека, чтобы выразить свой инструмент CRISPRa в нейронах. Затем исследователи UAB разработали однонаправляющие РНК CRISPR для нацеливания этой системы на ряд различных генов, от небольших факторов транскрипции до крупных внеклеточных белков. Они показали, что эта система значительно индуцировала экспрессию каждого из этих генов-мишеней в первичных нейронах крыс из коры, гиппокампа и полосатого тела головного мозга.
Использование нескольких однонаправленных РНК, называемых мультиплексированием, позволило настраивать повышающую регуляцию отдельных генов или скоординированную повышающую регуляцию нескольких генов.
Команды UAB также протестировали систему на очень сложном гене мозга, нейротрофическом факторе мозга или Bdnf. Bdnf чрезвычайно сложно изучать из-за его сложной регуляции транскрипции, но он важен из-за его центральной роли в различных процессах, таких как дифференцировка и выживание нейронов, рост дендритов, синаптическое развитие, долгосрочное потенцирование и формирование памяти. Bdnf имеет девять различных положений промотора, и каждое приводит к варианту транскрипта мРНК.
«Из-за этой сложности попытки охарактеризовать различные функциональные роли отдельных мРНК Bdnf в нейронах дали противоречивые результаты, а доступные в настоящее время инструменты либо не обладают способностью избирательно повышать регуляцию отдельных вариантов транскрипта Bdnf, либо требуют громоздких протоколов молекулярного клонирования для генерации специфичного для генов нацеливания. конструкции ", сказал Дэй.
Дэй и его коллеги смогли использовать свою систему CRISPR-dCas9 для целевого нацеливания отдельных промоторов на два разных сайта на Bndf. Каждый индуцировал только транскрипт для этого сайта без изменения экспрессии на любом из других промоторов. Затем они охарактеризовали дифференциально экспрессируемые гены, индуцируемые ниже по течению каждым уникальным транскриптом, и измерили сопутствующие изменения в физиологии нейронов.
Наконец, исследователи подтвердили свою систему регуляции генов у взрослых крыс, используя стереотаксическую хирургию для введения лентивирусов, несущих CRISPRa, в префронтальную кору, гиппокамп и прилежащее ядро мозга.
«Я думаю, что мы только начинаем поверхностно разбираться в типах регуляции генов, которые сейчас возможны благодаря созданию подобных эффекторно-связанных инструментов dCas9», – сказала Кэтрин Дженсен Пена, доктор философии.D., доцент Принстонского института неврологии, не принимавший участия в исследовании. "Это открывает захватывающие возможности в нейробиологии, особенно для изучения сложных функций мозга и расстройств мозга."
Поддержка поступила из грантов Национального института здравоохранения DA039650, DA034681, MH114990, DA042514, MH112304 и DA041778; Civitan International Research Center при UAB; и программа стипендий UAB Pittman Scholars Program.